您不曾了解系列3—活细胞DNA染色

发布者:艾美捷科技发布时间:2019-04-28

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【前情回顾】前期小伙伴发表了2篇关于活细胞tubulin和F-actin染色的文章:

【1】您不曾了解系列:微管蛋白tubulin染色(活细胞),点击了解

【2】您不曾了解系列2:活细胞微丝F-actin染色(兼容固定细胞),点击了解

 

今天我们就来聊聊活细胞的DNA染色吧!

 

目前市面上有几种DNA荧光探针,如溴化乙锭(EB)、DAPI、Hoechst™和远红色染料,如SiR-DNA™ (SiR-Hoechst*) 、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。目前,在活细胞的DNA染色中,有两组染料。第一组是Hoechst系列,它们具有细胞渗透性和荧光性(即低荧光直到结合靶DNA),但由于340-360nm范围内短紫外-蓝色波长激发的要求,它们具有相当的毒性

 

第二组活细胞染料由远红外染料组成,如SiR-DNA™、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。这些染料克服了前一组光谱范围的限制,允许使用波长约为650nm、发射波长约为700nm的低能激发光。这种光具有最小的光毒性(SiR-Tubulin™和SiR-Actin™)并且细胞或组织样品在该光谱范围内不吸收光也不自发荧光,这使得在厚样本中有更深处成像成为可能。

 

相比之下,DAPI和溴化乙锭不具有细胞渗透性,DAPI需要短的紫外波长激发,EB是蓝光波长,在350 nm范围内非常有很好的活力,这两种染料活细胞成像超过1-10分钟,会对活细胞造成光损伤(氧化)。此外,在这个光谱范围内,组织和细胞具有很高的吸收率和自发荧光。因此,很难在组织样本的深处成像。最后,由于细胞暴露在激发光下的时间有限,这些染料不适合超分辨率分析,且溴化乙锭会导致细胞发生突变。

 

SiR-DNA™(SiR–Hoechst)是基于荧光团硅罗丹明(SiR)和DNA小槽粘合剂双苯甲酰亚胺(Hoechst)组合而成,它比远红外染料组其他染料更具优势。Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™红宝石染料的问题在于:它们要么在厂家建议使用的浓度下对细胞显示出强烈的毒性作用(细胞停止分裂或死亡),而SiR-DNA可以在8小时的正常实验时间内持续使用,而且可能更长。Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™等红宝石染料也在活细胞的DNA以外的其他结构上产生强烈的非特异性信号。SYTO61与超分辨显微镜兼容,但其高背景荧光和毒性使其不具有吸引力,SiR-DNA信号在多次暴露于激发光下时仍然很强,在稳定性测试中,在140次暴露/时间点记录后,染料保持了其原始强度的70%。

  SiR-DNA™比远红外染料组其他染料更具优势  

SiR–Hoechst(SiR-DNA™) 和其他远红外DNA染料长时间活细胞成像对比图,显示SiR–Hoechst的低毒性及荧光稳定性

 

 

市面上几种常见DNA染料对比

 

 

特性   SiR-DNA™   其他远红外染料 Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™   短波长染料
Hoechst™ DAPI、EB
 细胞毒性 8小时内持续使用对细胞无影响 厂家建议使用的浓度下对细胞显示出强烈的毒性作用(细胞停止分裂或死亡) 适用于活细胞,但细胞毒性高, 不适于活细胞,且EB致使细胞突变
细胞渗透性 有细胞渗透性 有细胞渗透性 有细胞渗透性 无细胞渗透性
特异性 针对于活细胞DNA,特异性非常好 Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™染料在活细胞的DNA以外的其他结构上产生强烈的非特异性信号 很高的吸收率和自发荧光,背景较高
超分辨显微镜兼容 在多次暴露于激发光下信号仍然很强 Syto61与超分辨显微镜兼容,但其高背景荧光和细胞毒性 不适合超分辨率分析

 

注:SiR-DNA™是Spirochrome SA公司的商标 (瑞士)

Vybrant® DyeCycle™ Ruby stain 和Syto61™是美国Thermo Fisher Scientific公司的商标

注:SiR-DNA™是Spirochrome SA公司的商标 (瑞士)

DRAQ5™是Biostatus公司商标

Hoechst™是美国Sanofi公司商标

 

SiR-DNA™的主要发展方向是将荧光特性高DNA特异性低毒性远红外激发/发射范围相结合。此外,由于其稳定性和对远红光的特性,探针在超分辨显微镜(STDE和SIM)中表现非常好。因此,SiR-DNA™是一种优良的探针,其性能与SiR-tubulin和SiR-actin一样优秀。

 

在显微镜观察和高通量筛选过程中,SiR-DNA™可以在不受紫外线刺激的情况下进行简单的核复染。在流式细胞术过程中,SiR-DNA™可以直接用于血液/BM的表型分析和细胞DNA含量分析,而无需红细胞溶解或固定、渗透或RNase处理等步骤。

 

说了这么多,您有没有对SiR-DNA™活细胞染料很心动了?作为专业的生命科学解决方案供应商,艾美捷科技为您推荐全球畅销的活细胞DNA染色试剂盒:

 

产品名称 Ex/Em 滤光镜 货号
SiR-DNA Kit 652/672nm 标准Cy5设置  CY-SC007

* 活细胞DNA染色试剂盒均内含Verapamil(维拉帕米,戊脉安),一种广谱的外排泵抑制剂。

 

厂家质检:

 

HeLa细胞有丝分裂延时成像 活体MCF-7乳腺癌细胞球体SiR-DNA染色 SiR-DNA染色活体人成纤维细胞,(灰色)和SiR(红色)通道叠加
HeLa细胞有丝分裂延时成像,有丝分裂是一个高度敏感的过程,显示SiR-DNA染料的低细胞毒性。 活体MCF-7乳腺癌细胞球体SiR-DNA染色。 SiR-DNA染色活体人成纤维细胞,(灰色)和SiR(红色)通道叠加。

 

 

常见问题整理:

 

 

是否兼容固定细胞?

 

SiR-DNA™可以与甲醇或PFA固定的细胞一起使用。然而,介质对SiR-DNA™的亮度有很大的影响。当混有PBS或Vectashield®的细胞产生很低的信号,混合有纯甘油的细胞会染出非常明亮的细胞核。因此,我们建议在用SiR-DNA™染色固定细胞时使用纯甘油作为介质。

 

哪些物种的样本和组织能被SiR探针染色?

 

下方仅引述已报告起作用的细胞系、组织或生物体。

智人:U2OS,成纤维细胞,HeLa,HUVEC, MCF-10A, HCT-116, A549,红细胞

肌肉:C2C12,IA32,骨骼肌,原代心肌细胞,原代卵母细胞

褐家鼠:初级海马神经元、初级皮质神经元、NRK

风信子:COS-7

金鲫:BHK

黑腹果蝇:Notum上皮,S2

迪德尔菲斯有袋动物:OK细胞

 

为什么SiR探针的背景比其他荧光团低?

 

SiR探针使用的是近红外/远红外光谱范围内的激发光,从而避免较短波长的光产生自发荧光,从而避免产生较高的背景。SiR耦合探针具有两种物理状态:①非荧光,关闭状态(spirolactone)和②高荧光,开启状态(zwitterion)。探针与其配体目标的结合有利于高荧光的开放状态,而未结合探针则存在于封闭、非荧光状态(下图)。从未结合态到结合态荧光放大率增加100倍。这就产生了一种高度敏感的生物传感器,其中大部分荧光只发生在结合态。

  SiR衍生物在荧光(开放)型(左结构)和非荧光(封闭)型(右结构)之间存在平衡

SiR衍生物在荧光(开放)型(左结构)和非荧光(封闭)型(右结构)之间存在平衡

 

 

Nature Communication 专属产品文章精彩了解:

 

G. Lukinavicius et al.,SiR–Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy, Nat. Commun. 6:8497 doi: 10.1038/ncomms9497 (2015).

  Nature Communication专属产品文章

不同类型细胞DNA成像图,4μm SiR–Hoechst

SiR-Hoechst染色HeLa细胞的共聚焦(confocal)和电镜(STED)对比

SiR-Hoechst染色HeLa细胞的共聚焦(confocal)和电镜(STED)对比

 

Cytoskeleton公司成立于1993年,专注于生物化学和细胞过程研究中的纯化蛋白和便捷试剂盒开发与生产。公司提供药物筛选、信号转导、蛋白质转录后修饰(PTM)、细胞骨架研究相关的系列试剂盒和产品,尤其以细胞骨架相关研究见长,既能满足于样品较少的科学研究,也可以用于小规模筛选研究和高通量大规模筛选研究。

 

目前主要的产品有340余种,其产品主要覆盖肌动蛋白,微管蛋白,马达蛋白,小G蛋白,细胞外基质,活细胞成像等相关领域,提供对应的蛋白质,抗体,检测与分析试剂盒,并且产品线还在不断的扩大中。此外,公司还提供微管蛋白,肌动蛋白,小G蛋白,GAPs,GEFs等现有产品的药物筛选服务。

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